|
·对照RNAi质粒按照实验用途可以分为阳性对照和阴性对照RNAi质粒。阳性对照用于优化、监控RNAi质粒转染条件、监控细胞状态和RNAi机制是否正常工作,阴性对照组应该不会出现靶基因的敲减。
·对照RNAi质粒按照靶基因的来源可分为内源性和外源性对照RNAi质粒,例如绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶等报告基因的siRNA为外源性对照RNAi质粒,而GAPDH、beta-actin等基因的RNAi质粒属于内源性对照RNAi质粒。
·需要注意的是外源性对照RNAi质粒一般应与相应的外源性基因表达载体一起输入靶细胞或靶组织,同时还应设立一个阴性组即只转染外源性基因的载体和/或阴性对照RNAi质粒。
·p53是核酸和蛋白定量实验中常用的内参照基因。人miR30-p53_RNAi质粒将编码针对人p53
siRNA的双链DNA嵌于miR30结构中。该质粒适用于转染真核细胞,可表达针对人p53的siRNA。该质粒以新霉素抗性基因作为筛选标记,可用于构建稳定表达靶基因shRNA的细胞株。该质粒在CMV的驱动下可表达绿色荧光蛋白(GFP),可用作示踪剂和转染效率检测。该质粒用于转录shRNA的启动子是人源H1。
·含microRNA-30结构的shRNA:美国冷泉港的研究者首先报道了利用人类microRNA-30的结构成功构建了shRNA表达质粒。经改造的miR30结构特征如下:发夹的stem部分即编码siRNA的DNA片段长为22bp,Loop(圈套)部分长19nt,125nt
的miR30侧翼序列接于发夹的任意一侧皆可,如此结构能将RNAi抑效提高十倍,即可将原本无效的常规shRNA的RNAi效果大为改善。 |